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宏基因组测序

时间:2015.03.25
            宏基因组学(Metagenomics)也称为元基因组学,是以样品中的微生物群落作为整体进行研究的学科,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,能够解释微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及环境之间的关系。
自然界中,约有99%的微生物是不能在实验室条件下进行纯化培养的。宏基因组学研究不要求对每个微生物进行分离纯化培养,而是直接从样品中提取基因组DNA后进行测序分析,这避免了文库构建过程中利用宿主菌对样品进行克隆而引起的系统偏差,简化了基本操作,提高了测序效率。因此极大地扩展了微生物的研究范围。
 
 
 
  •     技术路线
 
 推荐平台: Roche 454 FLX+、Illumina HiSeq 2000 
二、生物信息分析
 
1.    原始数据整理、过滤及质量评估
2.         基因集分析
l  基因功能注释
l  基因功能丰度差异分析
l  丰度差异的基因 GO 富集分析
l  丰度差异的基因 KEGG 富集分析
l  聚类分析(热图)
l  多元统计分析(根据实验设计)
3.    基于物种丰度分析:
l  稀释曲线
l  Alpha多样性分析
l  物种丰度差异分析
l  聚类分析(热图)
l  多元统计分析(根据实验设计)
4.    基于群落结构分析:
l  单样品物种分布
l  多样品物种分布
5.  微生物基因组序列组装和拼接
6.    根据客户需求进行个性化分析
三、样品要求
1.       样品采集:采集条件的一致是最为重要的环节,需严格按照标准采样,采样后立即冷冻保存。
2.       样品DNA:环境因素异常复杂,许多物质或抑制因子会影响后续PCR、测序文库构建和序列测定,常规提取方法不一定适合,建议按公司要求采用专用试剂盒提取。基因组DNA浓度>100 ng/μl,总量>10 μg,OD 260/280在1.8-2.0之间,并确保电泳检测无明显RNA条带,基因组条带清晰、完整;基因组DNA完全无降解;提供DNA电泳检测照片,用自封袋密封后随样品一起送样。
3.       样品保存期间切忌反复冻融。
4.       送样管务必标清样品编号,管口使用Parafilm膜密封。
四、经典案例
案例1:牛瘤胃中纤维素降解微生物的de novo测序
背景:纤维素是自然界中最丰富的碳水化合物资源。牛在反刍过程中涉及到纤维素的分解,研究牛的消化机制,将为寻找可用于生产生物燃料的酶奠定基础。
 
目的:研究人员将柳枝稷样品置于牛的瘤胃中培养72 h,采用Illumina平台对附着在样品上的所有微生物进行基因组分析。    
 
 
 
 
结论:测序分析得到268 Gb的宏基因组数据,确定了超过27,775个碳水化合物活性酶基因和15个高丰度不可培养的微生物基因组。将部分基因导入细菌,然后由这些细菌产生了90种蛋白质酶。这一数据集极大地丰富了纤维素相关降解微生物基因组及降解基因集。
 
[ Hess M, Sczyrba A, Egan R, et al. Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen. Science, 2011, 331(6016): 463-467 ]
五、常见问题解答
1.       Q:针对16S rDNA测序和宏基因组de novo测序有什么不同?
A:16S rDNA测序是针对细菌核糖体小亚基的特定高变区进行PCR扩增,反映物种的进化关系及群落多样性。
宏基因组de novo测序测定整个环境中所有微生物的基因组。在数据分析上又可以分为基因集分析和基因组组装。基因集分析可以进行功能分析(GO pathway);基因组组装可以获得新的,甚至是不可纯培养的微生物基因组序列。
 
2.   Q:宏基因组de novo测序对测序平台有什么要求?
     A:Illumina HiSeq 2000适合进行基因集的分析,要求每个样本测序量达到3G以上;Roche 454 FLX+长读长特性更适合新基因组序列的发现,更容易实现基因组拼接。

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